抗体亲和力成熟_抗体亲和力检测

抗体亲和力是指抗体与抗原相互结合的强度和特异性。在抗体产生初期，由于基因重组和突变等原因，抗体亲和力较低，但随着抗体不断 *** 和筛选，亲和力会逐渐成熟和增强。一般来说，抗体亲和力的成熟是在数周或数月内完成的，且成熟程度因人而异。亲和力成熟后，抗体与抗原的结合力会增强，从而提高免疫系统对病原体的识别和清除能力。

一：抗体亲和力成熟

抗体亲和力成熟(antibody afinity maturation)是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答。这种现象称为抗体亲和力成熟。它是由于抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对B细胞克隆的选择性激活。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果，对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。

在初次应答时，大量抗原可激活表达不同亲和力BCR的B细胞克隆，而这些B细胞克隆大多产生低亲和力抗体，当大量抗原被清除或再次免疫的，仅有少量抗原出现时，表达高清合力BCR的B细胞克隆会优先结合抗原，并得到扩增，最终产生高亲和力抗体，此即为抗体亲和力成熟

二：抗体亲和力是什么意思

抗体亲和力测定

抗体与抗原表位或抗原决定簇之间的结合力称为抗体亲和力，

抗体亲和力的大小可以用亲和力常数KD（单位为升/质量摩尔浓度）表示，其计算公式为

KD=[Ab▪H]/（[Ab][H]）

其中[ ]表示摩尔浓度，Ab表示抗体，H表示半抗原，Ab—H表示抗体与半抗原的结合物

亲和力常数KD越高，则抗体结合半抗原的能力越强

三：抗体亲和力检测

*仅供医学专业人士阅读参考

自1975年诞生以来[1]，单克隆抗体技术让人类掌握了来自免疫系统的神奇力量，癌症等多种疾病的治疗范式被彻底改写。

无论是面对病原物，还是癌细胞，单克隆抗体与抗原的高亲和力结合是治病的基础。因此，在过去的几十年里，高亲和力结合被开发治疗性抗体的研究人员奉为圭臬[2]。

然而，这个固有观念要被打破了！

近日，由南安普顿大学医学院Mark S. Cragg领衔的研究团队，在顶级期刊《自然》上发表了一项重磅研究成果[3]，让我们对抗体亲和力与抗肿瘤活性之间的关系，有了全新的认知。论文的第一

这项开创性的研究发现，激动型免疫调节抗体的亲和力与激动活性之间不是正相关关系，而是呈“钟型”关系。也就是说，在一定范围内，抗体的亲和力升高，它的激动活性也会升高；超过临界值之后，随着亲和力的升高，抗体的激动活性竟然会下降。

简单地说，激动型免疫调节抗体的亲和力不是越高越好。这个发现意味着，我们需要重新审视免疫调节抗体的开发理念了！

论文首页截图

亲历免疫治疗崛起和新冠疫情大爆发的我们，对抗体一定不陌生了。

以抗PD-1抗体为代表的免疫检查点抑制剂，成为与手术、化疗和放疗并驾齐驱的癌症疗法第四极。免疫检查点抑制剂属于信号阻断型抗体，已经有研究表明，这类抗体的亲和力越高，阻断效果越好[4]。针对病原物的抗体也有类似的趋势，抗体的亲和力越高，中和病毒的效果越好[5]。

不过，在癌症免疫治疗领域，除了抑制型抗体之外，直接激活免疫的激动型抗体也是一大研究方向[6]，例如肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的CD40和4-1BB[6]。激动型免疫调节抗体与这些共 *** 信号受体结合之后，或增强或激活人体免疫反应。目前这种类型的抗体，至少有数十种处于临床开发阶段。

TNFR家族的共 *** 受体[6]

遗憾的是，与抗PD-1抗体等抑制型免疫调节抗体不同，目前还没有研究探索激动型免疫调节抗体的亲和力如何影响其活力，高亲和力是否同样重要也不得而知。

为了填补上这块空白，俞晓杰博士以CD40作为主要研究对象，再辅以4-1BB和PD-1的相关研究，探索亲和力对激动型免疫调节抗体活性的影响。

CD40抗体他们选择的是处于临床研究阶段的ChiLob 7/4。在ChiLob 7/4的基础上，他们又设计了12个ChiLob 7/4的突变体，并证明这些突变体与CD40的结合表位与野生型ChiLob 7/4相同，这就排除了结合表位差异对抗体激动活性的影响。

随后，他们检测了所有抗体与CD40的亲和力，发现它们的解离常数（KD，数值越小亲和力越强）在5.22到925nM之间，其中ChiLob 7/4的解离常数是最小的5.22nM（也就是说它的亲和力最强）。

所有抗体与CD40的亲和力比较

接下来俞晓杰博士以表达CD40的B细胞为研究对象，通过B细胞活化标志物CD23/CD86的水平评估B细胞的活化和增殖情况。

研究结果出人意料。

与抑制型抗体不同，与CD40亲和力低的突变体竟然表现出了更强的激动活性。确切的来说，那是一个钟型曲线。

从数据上看，最具激动性的突变体FW-16（KD值从小到大排第9）和CDR-Y102A/Y32A（KD值从小到大排第10）诱导的CD23/CD86表达，分别比野生型ChiLob 7/4高约26倍和8倍；在B细胞增殖方面，激动性和亲和力之间也出现了同样的钟形曲线，激动性最强的突变体诱导的增殖量高出2倍。

不同突变体的激动活性比较

体内研究结果与体外保持一致，低亲和力突变体诱导了更高水平的抗原特异性CD8阳性T细胞扩增，其中最具激动性的突变体FW-16诱导的扩增比ChiLob 7/4高8倍。

低亲和力突变体诱导的肿瘤特异性T细胞反应，在肿瘤小鼠模型上发挥了更强大的抗肿瘤免疫反应。与具有最高亲和力的ChiLob 7/4相比，低亲和力突变体CDR-Y102A/Y32A能让更多小鼠存活下来。

这些数据说明，低亲和力抗CD40抗体在体外和体内都具备强大的激动活性，并且与高亲和力的ChiLob 7/4相比表现出更强大的抗肿瘤活性。

抗肿瘤活性的比较

在人类研究系统中，俞晓杰博士也证实了低亲和力抗体的激动活性更强。

那么问题就来了：为什么激动型免疫调节抗体的表现如此另类？背后的机制究竟是什么？

为了破解这个谜题，俞晓杰博士做了大量的研究，最后发现原来与高亲和力抗体相比，低亲和力抗体能诱导更高水平的CD40受体聚集。

CD40的聚集为何显得那么重要呢？原来抗体的激动作用就是受TNFR家族这些受体的聚集调节的，聚集一起的CD40越多，信号越强。更重要的是，这个过程不依赖于抗体Fc段的受体FcγR。荧光显微镜观察到的现象，也证实了上述发现。

荧光显微镜照片（上）和机制示意图（下）

围绕4-1BB的研究重现了CD40的研究结果，这说明对TNFR家族的抗体而言，低亲和力诱导的强激动活性是保守的。

在TNFR家族之外的PD-1的研究中，俞晓杰博士也观察到了类似的现象，高亲和力的PD-1抑制剂纳武利尤单抗不能诱导PD-1的超聚集，而纳武利尤单抗的低亲和力突变体则可以诱导PD-1的超聚集。

不过，我们都知道，PD-1信号通路被激活之后，给T细胞传递的负调节信号，会抑制T细胞的活性[7]。俞晓杰博士的实验结果也证实了之前的发现，低亲和力的纳武利尤单抗突变体会抑制T细胞的活性。也就是说，低亲和力的PD-1抑制剂可能不仅不能治疗癌症，反而会有利于癌症的进展。

总的来说，俞晓杰博士的这一研究表明，抗体的最佳亲和力取决于抗体的应用场景。如果是阻断型抗体，高亲和力最有效；如果是激动型抗体，那亲和力处于中间水平更好。

值得注意的是，到目前为止，针对TNFR家族的激动型抗体治疗癌症的临床表现令人失望。虽然失败的原因有很多，但是英国布里斯托大学的Christoph Wülfing等发现，很多激动型抗体是高亲和力抗体[8]。

或许俞晓杰博士的这项研究成果会重构激动型抗体的设计思路，让激动型免疫调节抗体成为免疫治疗的另一支重要力量。

参考文献：

[1].Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256(5517):495-497. doi:10.1038/256495a0

[2].https://www.southampton.ac.uk/youreit/news/2023/02/01/boosting-anti-cancer-antibodies-by-reducing-their-grip/

[3].Yu X, Orr CM, Chan HTC, et al. Reducing affinity as a strategy to boost immunomodulatory antibody agoni *** . Nature. 2023. doi:10.1038/s41586-022-05673-2

[4].Viant C, Weymar GHJ, Escolano A, et al. Antibody Affinity Shapes the Choice between Memory and Germinal Center B Cell Fates. Cell. 2020;183(5):1298-1311.e11. doi:10.1016/j.cell.2020.09.063

[5].Forthal DN. Functions of Antibodies. Microbiol Spectr. 2014;2(4):1-17.

[6].Mayes PA, Hance KW, Hoos A. The promise and challenges of immune agonist antibody development in cancer. Nat Rev Drug Discov. 2018;17(7):509-527. doi:10.1038/nrd.2018.75

[7].Curnock AP, Bossi G, Kumaran J, et al. Cell-targeted PD-1 agonists that mimic PD-L1 are potent T cell inhibitors. JCI Insight. 2021;6(20):e152468. doi:10.1172/jci.insight.152468

[8].Wülfing C, Dovedi SJ. For optimal antibody effectiveness, sometimes less is more. Nature. 2023;614(7948):416-418. doi:10.1038/d41586-023-00244-5

本文

四：抗体亲和力测定 ***

抗原和抗体的结合反应服从可逆反应的质量作用定律(mass action law) ,方程如下: [ A g + ] [ A b] = [ A gA b]。当反应达到平衡时,方程变形如下:K = [ A gA b]/[ A g ] ·[ A b]。其中, [ A g ] 、[ A b] 、[ A gA b]分别代表抗原抗体结合反应体系达到平衡时游离抗原、抗体和抗原抗体复合物的浓度, K 为亲和常数。将抗原固定于固相载体后,以[Ag ]代表固相载体上未与抗体发生结合的抗原。经EL ISA 测定后,OD值的大小就代表着抗原抗体发生结合后形成复合物的浓度大小。当抗体浓度极大时,抗原全部与抗体发生结合,此时OD 值不再增加,即所谓达到平台期,以OD100 表示。而当以OD50 来表示OD 值是平台期一半的情况时,理论上,结合于固相载体上的抗原恰好有一半与抗体发生结合。因此有: [ A g ] = [ A gA b] = 1/ 2[ A g ] T 。若控制实验条件使[ A g ] T = n[ A g ]′T ,亲和常数计算公式变形为: K = ( n - 1) / n[ A b]′T - [ A b] T 。如果考虑双价的情况如I gG,那么在公式中加入效价影响因素,于是有: K = ( n - 1) / 2 ( n[ A b]′T - [ A b] T 。

由此,通过公式计算不同浓度下的K 值,取平均值便可得到亲和常数。因而,在采用非竞争EL ISA 法测定抗体亲和常数的过程中,OD100 或OD50 及其相对应抗体浓度的科学测定显得格外重要。

非竞争法，用二元一次方拟合线性方程，EXCEL里有。